Šķidruma hromatogrāfija ir galvenā metode katras sastāvdaļas un piemaisījumu satura pārbaudei izejvielās, starpproduktos, preparātos un iepakojuma materiālos, taču daudzām vielām nav standarta metožu, uz kurām paļauties, tāpēc ir neizbēgami izstrādāt jaunas metodes. Šķidrās fāzes metožu izstrādē hromatogrāfijas kolonna ir šķidruma hromatogrāfijas kodols, tāpēc ļoti svarīgi ir izvēlēties piemērotu hromatogrāfijas kolonnu. Šajā rakstā autors paskaidros, kā izvēlēties šķidruma hromatogrāfijas kolonnu no trim aspektiem: vispārējās idejas, apsvērumi un pielietojuma joma.
A. Vispārējas idejas šķidruma hromatogrāfijas kolonnu izvēlei
1. Novērtējiet analizējamās vielas fizikālās un ķīmiskās īpašības: piemēram, ķīmisko struktūru, šķīdību, stabilitāti (piemēram, vai to ir viegli oksidēt/reducēt/hidrolizēt), skābumu un sārmainību utt., jo īpaši ķīmiskā struktūra ir atslēga. faktors, kas nosaka īpašības, piemēram, konjugētajai grupai ir spēcīga ultravioleto staru absorbcija un spēcīga fluorescence;
2. Nosakiet analīzes mērķi: vai ir nepieciešama augsta atdalīšana, augsta kolonnas efektivitāte, īss analīzes laiks, augsta jutība, augsta spiediena izturība, ilgs kolonnas kalpošanas laiks, zemas izmaksas utt.;
- Izvēlieties piemērotu hromatogrāfijas kolonnu: izprotiet hromatogrāfiskās pildvielas sastāvu, fizikālās un ķīmiskās īpašības, piemēram, daļiņu izmēru, poru izmēru, temperatūras toleranci, pH toleranci, analizējamās vielas adsorbciju utt.
- Apsvērumi, izvēloties šķidruma hromatogrāfijas kolonnas
Šajā nodaļā tiks apspriesti faktori, kas jāņem vērā, izvēloties hromatogrāfijas kolonnu no pašas hromatogrāfijas kolonnas fizikālo un ķīmisko īpašību viedokļa. 2.1 Pildvielas matrica
2.1.1. Silikagēla matrica Vairuma šķidruma hromatogrāfijas kolonnu pildvielas matrica ir silikagels. Šim pildvielu veidam ir augsta tīrība, zemas izmaksas, augsta mehāniskā izturība un viegli modificējamas grupas (piemēram, fenilsaite, aminosaite, ciānsaite utt.), bet pH vērtība un temperatūras diapazons, ko tas pieļauj, ir ierobežots: Lielākajai daļai silikagēla matricas pildvielu pH diapazons ir no 2 līdz 8, bet īpaši modificētu silikagēla fāžu pH diapazons var būt pat no 1,5 līdz 10, un ir arī īpaši modificētas silikagēla saistītās fāzes, kas ir stabilas pie zema pH, piemēram, Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, kas ir stabils pie pH 1 līdz 8; silikagela matricas augšējā temperatūras robeža parasti ir 60 ℃, un dažas hromatogrāfijas kolonnas var izturēt 40 ℃ temperatūru pie augsta pH.
2.1.2. Polimēru matrica Polimēru pildvielas galvenokārt ir polistirola-divinilbenzols vai polimetakrilāts. To priekšrocības ir tas, ka tie var panest plašu pH diapazonu – tos var izmantot diapazonā no 1 līdz 14, un tie ir izturīgāki pret augstām temperatūrām (var sasniegt virs 80 °C). Salīdzinot ar C18 pildvielām uz silīcija dioksīda bāzes, šāda veida pildvielām ir spēcīgāka hidrofobitāte, un makroporains polimērs ir ļoti efektīvs paraugu, piemēram, olbaltumvielu, atdalīšanai. Tā trūkumi ir tādi, ka kolonnas efektivitāte ir zemāka un mehāniskā izturība ir vājāka nekā pildvielām uz silīcija dioksīda bāzes. 2.2. Daļiņu forma
Lielākā daļa mūsdienu HPLC pildvielu ir sfēriskas daļiņas, bet dažreiz tās ir neregulāras daļiņas. Sfēriskās daļiņas var nodrošināt zemāku kolonnas spiedienu, augstāku kolonnas efektivitāti, stabilitāti un ilgāku kalpošanas laiku; izmantojot augstas viskozitātes kustīgās fāzes (piemēram, fosforskābi) vai ja parauga šķīdums ir viskozs, neregulārām daļiņām ir lielāks īpatnējais virsmas laukums, kas ir vairāk labvēlīgs abu fāžu pilnīgai darbībai, un cena ir salīdzinoši zema. 2.3. Daļiņu izmērs
Jo mazāks ir daļiņu izmērs, jo augstāka ir kolonnas efektivitāte un lielāka atdalīšana, bet sliktāka ir augsta spiediena pretestība. Visbiežāk izmantotā kolonna ir 5 μm daļiņu izmēra kolonna; ja atdalīšanas prasība ir augsta, var izvēlēties 1,5-3 μm pildvielu, kas ir labvēlīga dažu sarežģītu matricu un daudzkomponentu paraugu atdalīšanas problēmas risināšanai. UPLC var izmantot 1,5 μm pildvielas; 10 μm vai lielākas daļiņu izmēra pildvielas bieži izmanto daļēji sagatavošanas vai sagatavošanas kolonnām. 2.4. Oglekļa saturs
Oglekļa saturs attiecas uz saistītās fāzes proporciju uz silikagela virsmas, kas ir saistīta ar specifisko virsmas laukumu un saistītās fāzes pārklājumu. Augsts oglekļa saturs nodrošina lielu kolonnas ietilpību un augstu izšķirtspēju, un to bieži izmanto sarežģītiem paraugiem, kuriem nepieciešama augsta atdalīšana, taču, ņemot vērā ilgo mijiedarbības laiku starp abām fāzēm, analīzes laiks ir garš; zema oglekļa satura hromatogrāfijas kolonnām ir īsāks analīzes laiks, un tām var būt atšķirīga selektivitāte, un tās bieži izmanto vienkāršiem paraugiem, kuriem nepieciešama ātra analīze, un paraugiem, kuriem nepieciešami augstas ūdens fāzes apstākļi. Parasti oglekļa saturs C18 svārstās no 7% līdz 19%. 2.5 Poru izmērs un īpatnējais virsmas laukums
HPLC adsorbcijas līdzekļi ir porainas daļiņas, un lielākā daļa mijiedarbības notiek porās. Tāpēc molekulām ir jāiekļūst porās, lai tās adsorbētu un atdalītu.
Poru izmērs un īpatnējais virsmas laukums ir divi viens otru papildinoši jēdzieni. Mazs poru izmērs nozīmē lielu īpatnējo virsmu un otrādi. Liels īpatnējais virsmas laukums var palielināt mijiedarbību starp parauga molekulām un saistītajām fāzēm, uzlabot aizturi, palielināt parauga slodzi un kolonnas ietilpību, kā arī sarežģītu komponentu atdalīšanu. Pilnībā porainas pildvielas pieder pie šāda veida pildvielām. Tiem, kam ir augstas atdalīšanas prasības, ieteicams izvēlēties pildvielas ar lielu īpatnējo virsmu; mazs īpatnējais virsmas laukums var samazināt pretspiedienu, uzlabot kolonnas efektivitāti un samazināt līdzsvara laiku, kas ir piemērots gradienta analīzei. Pie šāda veida pildvielām pieder serdes apvalka pildvielas. Pamatojoties uz atdalīšanas nodrošināšanu, tiem, kam ir augstas analīzes efektivitātes prasības, ieteicams izvēlēties pildvielas ar mazu īpatnējo virsmu. 2.6. Poru tilpums un mehāniskā izturība
Poru tilpums, kas pazīstams arī kā "poru tilpums", attiecas uz tukšuma tilpuma lielumu uz daļiņas vienību. Tas var labi atspoguļot pildvielas mehānisko izturību. Pildvielām ar lielu poru tilpumu mehāniskā izturība ir nedaudz vājāka nekā pildvielām ar mazu poru tilpumu. Pildvielas, kuru poru tilpums ir mazāks vai vienāds ar 1,5 mL/g, galvenokārt tiek izmantotas HPLC atdalīšanai, savukārt pildvielas ar poru tilpumu lielāku par 1,5 mL/g galvenokārt izmanto molekulārās izslēgšanas hromatogrāfijā un zemspiediena hromatogrāfijā. 2.7. Ierobežošanas likme
Ierobežošana var samazināt savienojumu pīķus, ko izraisa mijiedarbība starp savienojumiem un atklātām silanola grupām (piemēram, jonu saite starp sārmainiem savienojumiem un silanola grupām, van der Vāla spēki un ūdeņraža saites starp skābiem savienojumiem un silanola grupām), tādējādi uzlabojot kolonnas efektivitāti un pīķa formu. . Nepārsegtas saistītās fāzes radīs atšķirīgu selektivitāti attiecībā pret savienotajām fāzēm, īpaši polāriem paraugiem.
- Dažādu šķidrumu hromatogrāfijas kolonnu pielietojums
Šajā nodaļā dažos gadījumos ir aprakstīts dažādu veidu šķidruma hromatogrāfijas kolonnu pielietojums.
3.1. Apgrieztās fāzes C18 hromatogrāfijas kolonna
C18 kolonna ir visbiežāk izmantotā apgrieztās fāzes kolonna, kas atbilst vairuma organisko vielu satura un piemaisījumu testiem, un tā ir piemērojama vidēji polārām, vāji polārām un nepolārām vielām. C18 hromatogrāfijas kolonnas veids un specifikācija jāizvēlas atbilstoši īpašajām atdalīšanas prasībām. Piemēram, vielām ar augstām atdalīšanas prasībām bieži izmanto 5 μm * 4,6 mm * 250 mm specifikācijas; vielām ar sarežģītām atdalīšanas matricām un līdzīgu polaritāti var izmantot 4 μm * 4,6 mm * 250 mm specifikācijas vai mazāku daļiņu izmēru. Piemēram, autors izmantoja 3 μm * 4, 6 mm * 250 mm kolonnu, lai noteiktu divus genotoksiskus piemaisījumus celekoksiba API. Abu vielu atdalīšana var sasniegt 2,9, kas ir lieliski. Turklāt, lai nodrošinātu atdalīšanu, ja nepieciešama ātra analīze, bieži tiek izvēlēta īsa 10 mm vai 15 mm kolonna. Piemēram, kad autors izmantoja LC-MS/MS, lai noteiktu genotoksisku piemaisījumu piperahīna fosfāta API, tika izmantota 3 μm * 2, 1 mm * 100 mm kolonna. Atdalījums starp piemaisījumu un galveno komponentu bija 2,0, un parauga noteikšanu var pabeigt 5 minūtēs. 3.2. Apgrieztās fāzes fenilkolonna
Fenila kolonna ir arī apgrieztās fāzes kolonnas veids. Šāda veida kolonnām ir spēcīga selektivitāte pret aromātiskajiem savienojumiem. Ja aromātisko savienojumu reakcija, ko mēra ar parasto C18 kolonnu, ir vāja, varat apsvērt fenilkolonnas nomaiņu. Piemēram, kad es veidoju celekoksiba API, galvenā komponenta reakcija, ko mēra ar tā paša ražotāja fenilkolonnu un to pašu specifikāciju (visi 5 μm * 4,6 mm * 250 mm), bija apmēram 7 reizes lielāka nekā C18 kolonnā. 3.3. Normālās fāzes kolonna
Kā efektīvs papildinājums apgrieztās fāzes kolonnai normālās fāzes kolonna ir piemērota ļoti polāriem savienojumiem. Ja maksimums joprojām ir ļoti ātrs, eluējot ar vairāk nekā 90% ūdens fāzi apgrieztās fāzes kolonnā, un pat tuvu šķīdinātāja maksimumam un pārklājas ar to, varat apsvērt normālās fāzes kolonnas nomaiņu. Šāda veida kolonnas ietver hilic kolonnu, aminokolonnu, ciāno kolonnu utt.
3.3.1. Hilic kolonna Hilic kolonna parasti iekļauj hidrofilās grupas saistītajā alkilķēdē, lai uzlabotu reakciju uz polārām vielām. Šāda veida kolonna ir piemērota cukura vielu analīzei. Autore izmantoja šāda veida kolonnas, veicot ksilozes un tās atvasinājumu saturu un radniecīgās vielas. Ksilozes atvasinājuma izomērus var arī labi atdalīt;
3.3.2. Aminokolonna un ciānkolonna Aminokolonna un ciānkolonna attiecas uz aminoskābju un ciāngrupu modifikāciju ieviešanu attiecīgi saistītās alkilķēdes beigās, lai uzlabotu selektivitāti pret īpašām vielām: piemēram, aminokolonna ir laba izvēle. cukuru, aminoskābju, bāzu un amīdu atdalīšanai; ciānkolonnai ir labāka selektivitāte, atdalot hidrogenētas un nehidrogenētas struktūras līdzīgas vielas konjugētu saišu klātbūtnes dēļ. Aminokolonnu un ciāno kolonnu bieži var pārslēgt starp parastās fāzes kolonnu un reversās fāzes kolonnu, taču bieža pārslēgšana nav ieteicama. 3.4. Hirālā kolonna
Hirālā kolonna, kā norāda nosaukums, ir piemērota hirālo savienojumu atdalīšanai un analīzei, īpaši farmācijas jomā. Šāda veida kolonnu var uzskatīt, ja parastās apgrieztās fāzes un normālās fāzes kolonnas nevar nodrošināt izomēru atdalīšanu. Piemēram, autors izmantoja 5 μm * 4,6 mm * 250 mm hirālo kolonnu, lai atdalītu divus 1,2-difeniletilēndiamīna izomērus: (1S, 2S)-1, 2-difeniletilēndiamīnu un (1R, 2R)-1, 2. -difeniletilēndiamīns, un attālums starp abiem sasniedza aptuveni 2,0. Tomēr hirālās kolonnas ir dārgākas nekā cita veida kolonnas, parasti 1W+/gab. Ja šādas kolonnas ir vajadzīgas, vienībai ir jāparedz pietiekams budžets. 3.5 Jonu apmaiņas kolonna
Jonu apmaiņas kolonnas ir piemērotas lādētu jonu, piemēram, jonu, olbaltumvielu, nukleīnskābju un dažu cukura vielu, atdalīšanai un analīzei. Pēc pildvielas veida tās iedala katjonu apmaiņas kolonnās, anjonu apmaiņas kolonnās un spēcīgas katjonu apmaiņas kolonnās.
Katjonu apmaiņas kolonnas ietver kolonnas uz kalcija un ūdeņraža bāzes, kas galvenokārt ir piemērotas katjonu vielu, piemēram, aminoskābju, analīzei. Piemēram, autore izmantoja kolonnas uz kalcija bāzes, analizējot kalcija glikonātu un kalcija acetātu skalošanas šķīdumā. Abām vielām bija spēcīga reakcija pie λ=210 nm, un atdalīšanas pakāpe sasniedza 3,0; autore izmantoja kolonnas uz ūdeņraža bāzes, analizējot ar glikozi saistītas vielas. Vairākām galvenajām radniecīgām vielām – maltozei, maltotriozei un fruktozei – bija augsta jutība ar diferenciālajiem detektoriem, ar noteikšanas robežu līdz 0,5 ppm un atdalīšanas pakāpi 2,0–2,5.
Anjonu apmaiņas kolonnas galvenokārt ir piemērotas anjonu vielu, piemēram, organisko skābju un halogēna jonu, analīzei; Spēcīgām katjonu apmaiņas kolonnām ir lielāka jonu apmaiņas jauda un selektivitāte, un tās ir piemērotas sarežģītu paraugu atdalīšanai un analīzei.
Iepriekš minētais ir tikai ievads vairāku izplatītu šķidruma hromatogrāfijas kolonnu veidiem un pielietojuma diapazoniem apvienojumā ar paša autora pieredzi. Ir arī citi īpašie hromatogrāfijas kolonnu veidi, piemēram, lielu poru hromatogrāfijas kolonnas, mazu poru hromatogrāfijas kolonnas, afinitātes hromatogrāfijas kolonnas, daudzmodu hromatogrāfijas kolonnas, īpaši augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfijas kolonnas (UHPLC), superkritiskās šķidruma hromatogrāfijas kolonnas ( SFC) utt. Viņiem ir svarīga loma dažādās jomās. Konkrētais hromatogrāfijas kolonnas veids jāizvēlas atbilstoši parauga struktūrai un īpašībām, atdalīšanas prasībām un citiem mērķiem.
Publicēšanas laiks: 14. jūnijs 2024